Igromicina B.

CAS: 31282-04-9

Formula molecolare: C20h37n3o13

Peso molecolare: 527.52

Purezza: > 90%

Proprietà chimiche: Polvere da bianca a quasi bianca, facilmente solubile in acqua, metanolo ed etanolo.

Scopo: Ricerca biochimica

Meccanismo d'azione: L'igromicina B è un antibiotico aminoglicosidico prodotto dal metabolismo di Streptomyces hygroscopicus. Uccide batteri, funghi e cellule eucariotiche superiori inibendo la sintesi proteica. L'igromicina B inibisce la sintesi proteica interferendo con la traslocazione ribosomica degli anni 70 e inducendo una lettura errata dello stampo di mRNA. Attualmente, viene spesso usato per selezionare e mantenere le cellule procariotiche o eucariotiche con gene di resistenza all'igromicina.

Gene di resistenza:

La resistenza all'igromicina B deriva dal gene codificante per l'igromicina B fosfotransferasi (HPH). Finora sono state trovate due fonti:
Gene di resistenza HPH prodotto da Streptomyces hygroscopicus;
Gene di resistenza HPH portato da granuli endoplasmatici di Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae (comunemente usato);

Applicazioni biologiche:

1) screening e mantenimento della coltura di cellule procariotiche o cellule eucariotiche (cellule vegetali e cellule di mammifero) stabilmente trasfettate con vettore HPH +;

2) a causa della differenza di modo di azione, esso viene spesso confrontato con G418 (geneticintm) e zeocin ™ combinati con blasticidina s, linee cellulari stabilmente trasfettate con due vettori differenti sono state vagliate;
 
3) agente antivirale, l'igromicina B penetra selettivamente in cellule con permeabilità aumentata dovuta all'infezione virale, ed ha l'effetto di inibire la traduzione;

4) aggiungere l'alimentazione animale come repellente per insetti;

Concentrazione applicazione:

La concentrazione di lavoro di igromicina B utilizzata per selezionare ceppi transgenici stabili deve variare in base al tipo di cellula, al mezzo di coltura, alle condizioni di crescita e al tasso metabolico cellulare. La concentrazione raccomandata è 50-1000 μ G/ml, la concentrazione ottimale deve essere determinata dalla curva di uccisione.

Cellule di mammifero·200-500 μ g/ml; batteri/cellule vegetali·100-300 μ g/ml; funghi·300-1000 μ g/ml;
Utilizzo del prodotto:

Utilizzare 1: Curva di kill per determinare la migliore concentrazione di kill (solo per riferimento, varia in base al sistema di rilevamento individuale)

(1) cellule non transfettate sono state aggiunte a piastre a 96 pozzetti di grado di coltura tissutale, con una densità cellulare di circa 50-200 cellule/pozzetto; dopo che la cellula aderisca alla parete, concentrazioni differenti (ad esempio 50-1000) vengono aggiunti a ciascun pozzetto μ G/ml, almeno 5 concentrazioni) 200% di terreno fresco di igromicina B μ L;

(2) le cellule sono state incubate in incubatore a C02 al 5% a 37 ºC per 10-14 giorni;

(3) dopo 5-7 giorni di coltura, sostituire con un nuovo mezzo di coltura, che contiene igromicina B di concentrazione corrispondente;

(4) dopo 10-14 giorni, sono stati utilizzati metodi di proliferazione cellulare come MTT e CCK-8 per valutare la vitalità cellulare; gli effetti tossici possono anche essere determinati rilevando il numero di cloni cellulari o la percentuale di confluenza. Generalmente, la concentrazione minima che può uccidere tutte le cellule in 10-14 giorni è la migliore concentrazione di screening.

Uso 2: Cellule trasfettate stabili allo screening

(1) per cellule aderenti, aspirare direttamente il mezzo di coltura cellulare transfettato in una piastra di coltura da 60 mm, e quindi aggiungere 5-6 ml di terreno di coltura fresco contenente igromicina B; Per le cellule sospese, la condizione sterile è stata di 250 x g, centrifugata per 10 minuti per rimuovere il vecchio mezzo di coltura cellulare transfettato, e poi sospesa in circa 5 ml di mezzo fresco contenente igromicina B;

(2) dopo 5-7 giorni, sostituire il terreno fresco contenente igromicina B come sopra;

(3) le cellule sono state incubate per 5-7 giorni;

(4) dopo 10-14 giorni di incubazione, il sistema di coltura conteneva solo cellule viventi che potevano esprimere fenotipo di resistenza all'igromicina B. Pertanto, dopo lo screening, sostituire il terreno fresco senza igromicina B come nella fase 1.